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答疑丨wb背景黑是因為什么?

  • 分類:技術(shù)支持
  • 作者:
  • 來源:https://pro.biomart.cn/lab-web/que/316nrk8go403k/33vrnv2go26vb.html
  • 發(fā)布時間:2024-11-14
  • 訪問量:0

【概要描述】

答疑丨wb背景黑是因為什么?

【概要描述】

  • 分類:技術(shù)支持
  • 作者:
  • 來源:https://pro.biomart.cn/lab-web/que/316nrk8go403k/33vrnv2go26vb.html
  • 發(fā)布時間:2024-11-14
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詳情

Western Blotting(wB)的背景比較黑且條帶不清晰的原因可能有很多。以下是一些常見的可能原因:
1. 過度染色:如果樣品中的蛋白質(zhì)含量較高,可能會導(dǎo)致過度染色,使得背景變黑且條帶不清晰。建議優(yōu)化染色的時間和濃度,避免過度染色。
2. 組織破碎:如果組織破碎不完整,可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)在膜上擴(kuò)散或形成模糊的條帶。建議在制備樣品時加入足夠的保護(hù)劑和蛋白酶抑制劑,避免蛋白質(zhì)的破壞和降解。
3. 次要抗體問題:次要抗體可能存在污染或交叉反應(yīng),導(dǎo)致背景比較黑。建議使用高質(zhì)量的次要抗體,確保其特異性和純度。
4. 蛋白質(zhì)不純:如果樣品中存在其他蛋白質(zhì),可能會導(dǎo)致背景比較黑。建議使用高純度的蛋白質(zhì)樣品,避免其他蛋白質(zhì)的干擾。
5. 轉(zhuǎn)印問題:如果轉(zhuǎn)印條件不合適,可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的擴(kuò)散和條帶模糊。建議優(yōu)化轉(zhuǎn)印條件,確保蛋白質(zhì)可以均勻地轉(zhuǎn)移到膜上,并避免過度轉(zhuǎn)印。
綜上所述,要解決WB背景比較黑且條帶不清晰的問題,需要仔細(xì)檢查每個步驟,并根據(jù)具體情況進(jìn)行優(yōu)化。

 

考慮以下幾點原因:
1.膜污染
2.曝光時膜上發(fā)光液不足
3.封閉時間不夠
4.封閉液不合適
5.TBST被污染
6.洗滌不徹底
7.抗體濃度可能過高
8.抗體和封閉劑之間的交叉反應(yīng)
建議按以下幾點處理:
1.使用干凈的鑷子并戴上手套操作,以防止膜污染。
2.使膜充分浸在發(fā)光液中
3.增加封閉孵育時間
4.換其他封閉液(5%脫脂奶粉、5%BSA)
5.使用新的TBST
6.增加洗滌時間和洗滌緩沖液的體積
7.降低一抗或二抗的濃度
8.用TBST配制抗體和封閉液,吐溫可以減少交叉反應(yīng)。

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