小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)

巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對(duì)象，RAW264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞）就是科學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用到的細(xì)胞系，其來源為雄性Abelson鼠科白血病病毒誘導(dǎo)的腫瘤。RAW264.7培養(yǎng)有許多注意事項(xiàng)，在培養(yǎng)過程中容易出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)改變（長(zhǎng)出偽足）、消化困難、生長(zhǎng)緩慢等問題。由于細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是存在較大影響的，所以今天就來和大家分享一下RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn)。

一、細(xì)胞的形態(tài)與特點(diǎn)

RAW264.7細(xì)胞一般為圓形或橢圓形，小而透亮。因?yàn)槠渚哂休^強(qiáng)的吞噬能力，并在吞噬抗原后釋放趨化因子，促使細(xì)胞分化出偽足，粘附攀爬能力也因此增強(qiáng)。若細(xì)胞吞噬抗原過多、培養(yǎng)環(huán)境惡劣就會(huì)促使細(xì)胞呈現(xiàn)出梭形、長(zhǎng)梭形，鏡下觀察就會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)變?yōu)樗笮吻颐娣e變大，不再是具有細(xì)長(zhǎng)偽足的類圓形小細(xì)胞。這也是出現(xiàn)消化困難的一個(gè)主要原因。

二、培養(yǎng)注意事項(xiàng)和要點(diǎn)

1. 由于RAW264.7細(xì)胞易有不同形態(tài)，傳代時(shí)就會(huì)發(fā)現(xiàn)形態(tài)變?yōu)樗笮蔚募?xì)胞很難消化下來，輕敲培養(yǎng)皿細(xì)胞不會(huì)脫落，用力吹打又容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大損傷，因此要盡量避免細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變。即在接種細(xì)胞時(shí)保持一個(gè)適中的傳代密度，避免其向終末細(xì)胞分化，因?yàn)橐坏┘?xì)胞發(fā)生分化變?yōu)殚L(zhǎng)形是無法恢復(fù)的，這是培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞時(shí)最需要注意的問題。

2. RAW264.7細(xì)胞喜歡連片生長(zhǎng)，正常狀態(tài)下應(yīng)該是一小片一小片的分布在培養(yǎng)皿中，片片之間不相連接，等到長(zhǎng)到更多更密的時(shí)才會(huì)連成大片，但同時(shí)也會(huì)疊加成層，容易出現(xiàn)部分細(xì)胞飄起無法貼壁的問題。所以，要關(guān)注好細(xì)胞的匯合程度，控制好細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，不能等到疊加成層時(shí)才去傳代。

3. RAW264.7細(xì)胞傳代后貼壁時(shí)間較短，半小時(shí)左右絕大部分細(xì)胞就能夠貼下去，剛貼壁時(shí)細(xì)胞呈圓形，折光度很好，鏡下觀察如小珍珠狀一個(gè)個(gè)地散落于培養(yǎng)皿中。生長(zhǎng)一段時(shí)間后，部分細(xì)胞會(huì)變成類似四角形，伸出偽足之類的。這個(gè)時(shí)候就是在提醒你注意傳代了，此時(shí)無論匯合度如何都需要進(jìn)行傳代了，因?yàn)樾螒B(tài)發(fā)生改變的細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生較大影響，最終造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不理想。

4. 在細(xì)胞生長(zhǎng)的初始階段，細(xì)胞以貼壁的形式生長(zhǎng)并呈現(xiàn)出長(zhǎng)方體的形態(tài)和有“偽足”延伸。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞呈現(xiàn)圓形并以疊加的形式生長(zhǎng)。細(xì)胞密度達(dá)到一定的程度，會(huì)有細(xì)胞以懸浮的方式散落到到培養(yǎng)基中，鏡下觀察會(huì)同時(shí)出現(xiàn)懸浮和貼壁兩種形態(tài)。

5. 該細(xì)胞傳代時(shí)不需要用胰酶消化。傳代時(shí)，吸走部分培養(yǎng)液，留下少許培養(yǎng)液（例如使用T25培養(yǎng)瓶留下2 ml），用無菌細(xì)胞刮刮拭培養(yǎng)表面將細(xì)胞刮落，充分吹打后接種到新的裝有新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，混勻后進(jìn)行培養(yǎng)。

6. 該細(xì)胞形態(tài)上包含松散貼壁的紡錘形和圓形或者立方形。當(dāng)細(xì)胞密度較大時(shí)，細(xì)胞會(huì)輕微脫落變圓或者許多細(xì)胞堆積在一起，有些細(xì)胞甚至脫落漂浮。這些漂浮的細(xì)胞是存活的，在傳代時(shí)應(yīng)收起來，離心后細(xì)胞沉淀可以繼續(xù)培養(yǎng)。

7. 血清質(zhì)量差異可能引起細(xì)胞貼壁能力變化，建議選用高質(zhì)量的胎牛血清。

三、復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代和凍存

復(fù)蘇：從液氮罐中取出細(xì)胞轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱平衡溫度，準(zhǔn)備15mL離心管根據(jù)需求加入適量預(yù)熱過的完全培養(yǎng)基（細(xì)胞凍存懸液：完全培養(yǎng)基=1:6），37℃水浴鍋孵育，復(fù)溫后吸出細(xì)胞懸液至15ml離心管，離心去除凍存上清后，根據(jù)細(xì)胞量用新鮮培液重懸，轉(zhuǎn)移至合適大小的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，第二天換液。

培養(yǎng)：DMEM-HD+ 10% FBS；5% CO2 ，37.0°C

傳代：去除培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)基，滴加1×PBS清洗一遍，去除PBS，加胰酶消化，隨時(shí)觀察消化程度，加入完全培養(yǎng)基終止消化（胰酶：完全培養(yǎng)基=1:2），收集細(xì)胞懸液離心（一般為1100轉(zhuǎn),4分鐘），去除上清，根據(jù)需求確定傳代比例（約1:3～1：6傳代/3d），用新鮮培養(yǎng)基輕柔吹打重懸，鋪回皿中晃勻。

凍存：無血清凍存液，直接放至在-80℃冰箱，注意受冷要均勻，第二天轉(zhuǎn)入液氮。

四、具體解決方案

在培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞的過程中容易遇到的問題主要包括以下幾種及解決辦法：

1.復(fù)蘇后存活率不高

  原因： RAW264.7細(xì)胞不同生長(zhǎng)密度下細(xì)胞形態(tài)不同，若復(fù)蘇密度太高，細(xì)胞增殖過快，會(huì)加劇細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)缺失，加速細(xì)胞老化；若復(fù)蘇密度太低，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。

  解決辦法： 直徑10cm的培養(yǎng)皿復(fù)蘇細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量控制在1.0×106~1.5×106個(gè)

2.細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變異

  原因： RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境惡劣或吞噬過多抗原后會(huì)促使該細(xì)胞呈現(xiàn)梭形、長(zhǎng)梭形，形態(tài)發(fā)生變化。

  解決辦法： 改善細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，例如與細(xì)胞接觸的器皿保證無菌，使用質(zhì)量較高的胎牛血清。

3.不同形態(tài)細(xì)胞消化時(shí)間不等

  原因： 細(xì)胞老化后，形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞偽足變得多且長(zhǎng)，這使得這種形態(tài)的細(xì)胞變得較難消化，使用胰酶長(zhǎng)時(shí)間消化又會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大損傷。

  解決辦法： 可在正常時(shí)間終止消化，收集大部分正常狀態(tài)的細(xì)胞，再加入新的胰酶繼續(xù)消化，而偽足過多過長(zhǎng)的細(xì)胞，即使加胰酶消化10min及以上也是難以消化下來的，勉強(qiáng)消化下來，對(duì)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也會(huì)產(chǎn)生較大影響，即沒必要每次傳代都收集全部細(xì)胞，已經(jīng)發(fā)生分化的細(xì)胞無需保留要及時(shí)丟棄。

4.細(xì)胞生長(zhǎng)速度緩慢

  原因： 傳代時(shí)匯合度過低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，甚至難以貼壁，或是細(xì)胞發(fā)生了支原體污染。

  解決辦法： 定期傳代，控制好傳代比例，匯合度不可過低。及時(shí)進(jìn)行支原體檢測(cè)，如發(fā)現(xiàn)污染，即刻使用支原體去除試劑進(jìn)行清除。